Флюоресцентная гибридизация in situ. Применение технологии FISH. Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) в диагностике хромосомных болезней Флуоресцентная гибридизация in situ

30.03.2022

Стандартные микроскопы не дают возможности провести исследование клеток на молекулярном уровне. Одного только мощного увеличения здесь недостаточно. Необходима цифровая обработка изображений, дополнительные реагенты и другие материалы и приборы. Для анализа ДНК и РНК в настоящее время используется метод, который называется гибридизацией In situ. Поскольку он предполагает окрашивание образцов с последующим анализом излучения, его также называют флуоресцентной гибридизацией или методом FISH.

Флуоресцентная гибридизация In situ широко применяется в генетических исследованиях, при диагностике онкологических заболеваний, во время ведения беременности и многих других областях науки. В основу метода, как следует из названия, положено свойство молекул ДНК и РНК образовывать устойчивые связи с зондами, то есть образовывать гибридные молекулы. Слова «In situ» означают, что все наблюдения производятся «на месте», то есть напрямую без использования дополнительной среды.

ДНК-зонды (пробы) комплементарны молекулам в исследуемом образце. В их состав входят нуклеозиды, которые помечаются флюорофорами (веществами, которые придают молекуле свойство флуоресценции). Этот метод называется прямым мечением; если же в качестве маркеров используются гибридные молекулы-конъюгаты, то получается непрямое мечение. При прямом мечении гибридизацию можно наблюдать во флуоресцентный микроскоп сразу после ее завершения. Для непрямого мечения проводится еще одна процедура окрашивания. Она отделяет по цвету молекулы-конъюгаты от исследуемых образцов.

Способ гибридизации с непрямым мечением требует больше времени и реактивов, однако он позволяет добиться более достоверных результатов. Уровень сигнала в этом случае будет выше, а кроме того, возможно и его ступенчатое усиление. В качестве зондов для мечения используются клонированные последовательности ДНК (продукты ПЦР, геномная ДНК, меченые олигонуклеотиды и другие). Мечение зондов выполняется несколькими способами. Распространены методы ник-трансляции и полимеразной цепной реакции (ПЦР) с мечеными нуклеотидами.

Порядок проведения процедуры

Метод In situ начинается с подготовительного этапа - конструирования зондов. Размеры зондов не должны быть достаточно большими, чтобы не мешать процессу исследования. Слишком малые зонды тоже нежелательны, так как они не гарантируют достоверность результатов. Поэтому для исследований берут зонды размерами до 1 тысячи п.о. Если зонд является ДНК из двух цепочек, то перед гибридизацией кислоту денатурируют. При получении желаемого результата (окрашиваются определенные участки хромосом или же все хромосомы) дальнейшая гибридизация ДНК-проб с повторяющимися последовательностями блокируется. Для этого в гибридизационную смесь добавляются немеченые молекулы ДНК повторов.

Следующий этап исследований - приготовление препаратов интерфазных ядер или метафазных хромосом. Клетки фиксируются в субстрате на стекле, после чего выполняется денатурация ДНК. Для снижения температуры денатурации и сохранения морфологии ядер и хромосом денатурацию проводят с добавлением формадида. После этого к материалу добавляют зонды и выполняют гибридизацию в течение нескольких часов. По ее завершении проводится многоступенчатая отмывка для удаления зондов, не соединившихся с молекулами образцов.

Краткое описание

Флуоресцентная гибридизация in situ – это комбинация методов цитогенетики и молекулярной генетики. Принцип метода FISH заключается в гибридизации – связывании ДНК-зонда с хромосомной ДНК исследуемого образца пациента. Зонд представляет собой небольшой фрагмент ДНК, помеченный флуоресцентным красителем, который связывается с определенным участком хромосомы. Далее образцы исследуются с помощью флуоресцентной микроскопии при использовании подходящих для зондов светофильтров. С помощью метода FISH можно идентифицировать целые хромосомы, хромосомно-специфичные области или однокопийные уникальные последовательности, в зависимости от используемых методик маркировки.

Прикрепленные файлы: 1 файл

Особенностью FISH-метода, принципиально отличающей его от классического цитогенетического анализа, является то, что данный метод применим как для метафазных, так и для интерфазных ядер, что значительно упрощает работу и сокращает время, потраченное на исследование.На сегодняшний день существует широкий спектр ДНК-зондов для всех хромосом, а также для их отдельных участков, центромер и даже генов. Технология FISH позволяет определять количество копий хромосом в каждом сперматозоиде (исследование анеуплоидии).Помимо аномалий кариотипа наиболее частой генетической причиной бесплодия у мужчин являются нарушения сперматогенеза. Сперматогенез представляет собой сложный многоэтапный процесс, который контролируется большим количеством генов, расположенных как на аутосомах, так и на гоносомах (половых хромосомах), в особенности на Y-хромосоме. Так, микроделеции локуса AZF хромосомы Y обнаруживаются в среднем в 10-15% случаев азооспермии и в 5-10% случаев олигозооспермии тяжелой степени и обусловливают нарушения сперматогенеза и бесплодие у мужчин.

Принцип FISH-метода

В основе FISH-метода лежит реакция гибридизации между искусственно созданным ДНК-зондом и комплементраной ему нуклеотидной последовательностью ядерной ДНК. Молекула ДНК представляет собой две спирально соединенные нуклеотидные цепи, а гибридизация возможна только в том случае, если цепи разойдутся. Чтобы разъединить нуклеотидные цепи ДНК прибегают к денатурации (для последующей гибридизации денатурированной должна быть как ДНК в ядрах исследуемого образца, так и сам ДНК-зонд). После денатурации ДНК-зонд гибридизуется с комплементарной ему нуклеотидной последовательностью и может быть обнаружен при помощи флуоресцентного микроскопа.

Таким образом, общий вид протокола для постановки FISH можно представить в следующем виде:

1. Подготовка гистологического или цитологического препарата.

Подготовка гистологического препарата осуществляется по стандартной схеме: вырезка, маркировка, проводка, заливка, микротомия, помещение среза на предметное стекло и депарафинизация. При подготовке цитологического препарата используются специальные осаждающие растворы и центрифугирование, что позволяет получить концентрированную суспензию клеток.

2. Предварительная обработка (если необходимо).

Препарат обрабатывается протеазами, чтобы исключить присутствие белков, которые затрудняют гибридизацию.

3. Нанесение ДНК-зонда на препарат и последующая денатурация.

Для того, чтобы денатурировать зонд и ДНК образца, их обрабатывают формамидом и нагревают до температуры около 85-90°С.

4. Гибридизация.

После денатурации препарат охлаждают до определенной температуры (37°С в случае клинических исследований) и инкубируют во влажной камере в течение нескольких часов (продолжительность инкубации указана в каждом конкретном протоколе). В настоящее время для денатурации и гибридизации используют автоматические гибридайзеры.

5. Промывка.

После того, как гибридизация завершена, необходимо отмыть несвязавшиеся зонды, которые, в противном случае, создадут фон, затрудняющий оценку результатов FISH-анализа. Для промывки обычно используют раствор, содержащий цитрат и хлорид натрия (SSC).

6. Контр-окрашивание.

При помощи флуоресцентных красителей (DAPI - 4,6-диамидин-2-фенилиндол; йодид пропидия) проводится окраска всей ядерной ДНК.

7. Анализ результатов при помощи флуоресцентного микроскопа.

ДНК - зонды

При флюоресцентной гибридизации in situ используют ДНК-зонды (ДНК-пробы), которые связываются с комплементарными мишенями в образце. В состав ДНК-зондов входят нуклеозиды, меченные флюорофорами (прямое мечение) или такими конъюгатами, как биотин или дигоксигенин (непрямое мечение). При прямом мечении связавшийся с мишенью ДНК-зонд можно наблюдать при помощи флюоресцентного микроскопа сразу по завершении гибридизации. В случае непрямого мечения необходима дополнительная процедура окрашивания, в ходе которой биотин выявляют при помощи флуоресцентно-меченного авидина или стептавидина, а дигоксигенин - при помощи флюоресцентно-меченых антител. Хотя непрямой вариант мечения ДНК-проб требует дополнительных реактивов и временных затрат, этот способ позволяет добиться обычно более высокого уровня сигнала за счёт присутствия на молекуле антитела или авидина 3-4 молекул флюорохрома. Кроме того, в случае непрямого мечения возможно каскадное усиление сигнала.

FISH может применяться для различных целей с использованием зондов трех различных типов:

Локус-специфичные зонды, связывающиеся с определенными участками хромосом. Данные зонды используются для идентификации имеющейся короткой последовательности выделенной ДНК, которая используется для приготовления меченого зонда и его последующей гибридизации с набором хромосом,

Альфоидные или центромерные зонды-повторы представляют собой повторяющиеся последовательности центромерных областей хромосом. С их помощью каждая хромосома может быть окрашена в различный цвет, что позволяет быстро определить число хромосом и отклонения от нормального их числа,

Зонды на всю хромосому являются набором небольших зондов, комплементарных к отдельным участкам хромосомы, но в целом покрывающими всю ее длину. Используя библиотеку таких зондов можно "раскрасить" всю хромосому и получить дифференциальный спектральный кариотип индивида. Данный тип анализа применяется для анализа хромосомных аберраций, например транслокаций, когда кусочек одной хромосомы переносится на плечо другой.

Материалы для исследования

Материалом для исследования является кровь, костный мозг, биопсия опухоли, плацента, эмбриональные ткани или амниотическая жидкость. Образцы для исследования должны доставляться в лабораторию в свежем виде. Препараты (слайды) готовятся непосредственно из образцов ткани или после их культивирования. Могут использоваться как метафазные, так и интерфазные препараты клеток. Меченные флуоресцентными метками специфические ДНК- зонды гибридизуюся с хромосомной ДНК, причем можно одновременно использовать множественные зонды к разным локусам.

FISH является полезным и чувствительным методом цитогенетического анализа при выявлении количественных и качественных хромосомных аберраций, таких как делеции (в том числе и микроделеции), транслокации, удвоение и анэуплоидия. FISH на интерфазных хромосомах служит быстрым методом пренатальной диагностики трисомий по 21, 18 или 13 хромосомам или аберраций половых хромосом. В онкологии с помощью FISH можно выявлять рад транслокаций (bcr/abl, MLL, PML/RARA, TEL/AML1), связанных с гематологическими злокачественными новообразованиями. Метод также может использоваться для мониторинга остаточных явлений онкозаболевания после химиотерапии и пересадки костного мозга и выявления усиленных онкогенов (c-myc/n- myc), связанных с неблагоприятным прогнозом в отношении некоторых опухолей. FISH также используется для контроля приживаемости аллотрансплантата костного мозга, полученного от индивида противоположного пола.

FISH является чувствительным методом для идентификации хромосомных аберраций и одномоментного быстрого анализа большого (>500) числа клеток. Метод обладает высокой точностью при идентификации природы хромосом и неизвестных фрагментов хромосомной ДНК. Однако, флуоресцентная гибридизация in situ имеет один существенный недостаток. Зонды являются специфичными только к одному участку генома и, как следствие, при одном исследовании можно определить наличие или число копий только этого участка (или нескольких при использовании многоцветных зондов). Поэтому важным является правильная клиническя предпосылка, а FISH анализ может только подтвердить иди не подтвердить диагноз. В последнем случае анализ призодится повторять в отношении сходных синдромов и это далеко не всегда приносит желаемый результат. Альтернативой этому методу является хромосомный микроматричный анализ, который при такой же точности, чувствительности и специфичности определяет количество генетического материала в сотнях тысяч (и даже миллионах) точек генома, что дает возможность диагностики пактически всех известных микроделеционных и микродупликационных сииндромов.

Для создания ДНК проб используют клонированные последовательности ДНК, геномную ДНК, продукты ПЦР-реакции, меченые олигонуклеотиды, а также ДНК, полученную при помощи микродиссекции.Мечение зонда может осуществляться разными способами, например, путем ник-трансляции или при помощи ПЦР с мечеными нуклеотидами.

Процедура гибридизации

На первом этапе происходит конструирование зондов. Размер зонда должен быть достаточно большим для того, чтобы гибридизация происходила по специфическому сайту, но и не слишком большой (не более 1 тыс п.о), чтобы не препятствовать процессу гибридизации. При выявлении специфических локусов или при окраске целых хромосом надо заблокировать гибридизацию ДНК-проб с неуникальными повторяющимися ДНК-последовательностями путём добавления в гибридизационную смесь немеченой ДНК повторов (например, Cot-1 DNA). Если ДНК-зонд представляет собой двуцепочечную ДНК, то перед гибридизацией её необходимо денатурировать.На следующем этапе приготавливают препараты интерфазных ядер или метафазных хромосом. Клетки фиксируют на субстрате, как правило, на предметном стекле, затем проводят денатурацию ДНК. Для сохранения морфологии хромосом или ядер денатурацию проводят в присутствии формамида, что позволяет снизить температуру денатурации до 70°.Далее к препарату добавляют зонды и осуществляют гибридизацию около 12 часов. Затем проводят несколько стадий отмывок для удаления всех негибридизовавшихся зондов.

Визуализацию связавшихся ДНК-зондов проводят при помощи флуоресцентного микроскопа. Интенсивность флюоресцентного сигнала зависит от многих факторов - эффективности мечения зондом, типа зонда и типа флюоресцентного красителя.Изменения в генотипе родителей, приводящие к нарушению репродукции и невозможности зачатия ребенка естественным путем, при применении вспомогательных репродуктивных технологий могут передаваться будущему потомству. Этот факт указывает на необходимость предимплантационной генетической диагностики супружеских пар перед проведением программы ВРТ для профилактики рождения больного ребенка.

Метод FISH можно применять на любом клиническом/исследовательском микроскопе, обладающем функцией получения флуоресцентных изображений, например на микроскопах Olympus, Zeiss, и т.д.

Несмотря на то, что изображения могут быть получены и проанализированы вручную, для увеличения эффективности и точности также часто применяется программное обеспечение для анализа изображений в сочетании с автоматизированной микроскопией.Автоматизация метода FISH и развитие таких инновационных технологий, как сравнительная геномная гибридизация являются важным шагом в развитии репродуктивной и перинатальной медицины и ведут к улучшению качества и эффективности диагностики.

Приборы и реагенты для FISH – анализа

Методы FISH-диагностики стали широко использовать для исследования хромосомных аномалий в интерфазных ядрах, что особенно важно с практической точки зрения, так как метод экономичен и занимает мало времени. В норме, если например у пациента или плода есть дисомия по 21-й хромосоме, к ядре будут видны две флюоресцирующие цветные точки. При наличии трисомии хромосомы 21 (синдром Дауна) будут видны три точки.

Методы молекулярной цитогенетики позволили повысить верифицикацию хромосомных болезней. При использовании обычных цитогенетических анализов - доля невыявленных случаев составила 10 %, при использовании FISH-технологии - снизилась до 0,9-1,5 %. Исследования хромосомных синдромов базируются на основе использования различных типов ДНК-зондов, позволяющих маркировать (метить) индивидуальные хромосомы или их участки. Для успешного практического использования этих методов созданы специальные библиотеки хромосомоспецифичных участков ДНК. ДНК-зонды в последние годы метят различными цветами (цветные FISH-технологии), что позволяет не только повысить качество анализа и проанализировать количественные и структурные перестройки хромосом, но и осуществлять экспресс-диагностику, что особенно важно для пренатальной диагностики.

Традиционная цитогенетика при изучении кариотипа всегда была ограничена бэндовым уровнем разрешения. Даже при использовании высокоразрешающих методов дифференциального окрашивания хромосом мы всего лишь выявляли большее количество бэндов на хромосоме, но не были уверены, что добираемся до молекулярного уровня разрешения. Последние достижения ДНК-технологий и цитогенетики сделали возможным использование методов FISH для анализа изменений хромосомной ДНК на молекулярном уровне. Молекулярная цитогенетика обеспечила революционный прорыв в цитогенетике, позволив:

Осуществлять анализ структуры ДНК хромосом в диапазоне 10-100 килобаз;
проводить диагностику неделящихся интерфазных клеток, что оказало огромное влияние на пренатальную диагностику и преимплантационную генетическую диагностику (ПГД).

Технология FISH использует ДНК-зонд, который связывается или ренатурирует специфические последовательности ДНК внутри хромосомы. Денатурированный зонд инкубируется с нативной ДНК клетки, также денатурированной до одноцепочечного состояния. Зонд замещает биотин-дезоксиуридинтрифосфат или дигоксигенин-уридинтрифосфат на тимидин. После ренатурации зондом нативной ДНК комплекс «зонд-ДНК» можно обнаружить при добавлении меченного флюорохромом авидина, связывающегося с биотином, или меченного флюорохромом антидигоксигенина. Дополнительное усиление сигнала можно получить, добавив антиавидин и изучив получившийся комплекс с помощью флюоресцентной микроскопии. Пометив несколькими различными флюорохромами разные ДНК-зонды, можно одновременно визуализировать несколько хромосом или хромосомных сегментов внутри одной клетки в виде разноцветных сигналов.

Возможность определения специфических генных сегментов , имеющихся или отсутствующих на хромосомах, позволила диагностировать синдромы генных последовательностей на уровне ДНК, как, впрочем, и транслокации в интерфазных ядрах, зачастую - в отдельных клетках.

Материалом для FISH могут служить или метафазные хромосомы, полученные из делящихся клеток, или интерфазные ядра из клеток, не находящихся в стадии деления. Срезы предварительно обрабатывают РНКазой и протеиназой для удаления РНК, которая может вступать в перекрестную гибридизацию с зондом и хроматином. Затем их нагревают в формамиде, чтобы денатурировать ДНК, и фиксируют ледяным спиртом. Затем зонд подготавливают к гибридизации путем нагревания. После этого зонд и хромосомный препарат смешивают и герметизируют покровным стеклом при 37 °С для гибридизации. Изменяя температуру инкубации или солевой состав раствора для гибридизации, можно повысить специфичность связывания и уменьшить фоновую маркировку.

Применение флюоресцентной гибридизации in situ - технологии FISH

Эффективность технологии FISH впервые была продемонстрирована при локализации генов на . С внедрением метода флюоресцентного мечения, гибридизация in situ оказалась незаменимой для диагностики хромосомных аномалий, не выявляемых традиционными методами бэндинга. FISH также сыграла ключевую роль в совершении одного из самых необычных открытий современной генетики - геномного импринтинга.

Свое развитие технология FISH получила в трех формах. Центромерные, или альфа-сателлитные, зонды характеризуются относительной хромосомной специфичностью, их использовали чаще всего в генетике интерфазных клеток. Эти зонды генерируют в некоторой степени диффузные сигналы адекватной силы в области центромеры, но не вступают в перекрестную гибридизацию с хромосомами, имеющими аналогичные центромерные последовательности. В настоящее время разработаны однокопийные зонды, дающие дискретный сигнал от специфического бэнда хромосомы и позволяющие избежать феномена перекрестной гибридизации. Эти зонды также можно использовать для определения копийности и специфичных регионов хромосомы, предположительно связанных с тем или иным синдромом. Однокопийные и центромерные зонды, разработанные для хромосом 13, 18, 21, X и Y, используют для пренатальной диагностики.

Возможно также «окрашивание» целых хромосом с помощью FISH . Благодаря технологии спектрального кариотипирования, при которой используют смесь различных флюорохромов, теперь стало возможным создание уникального флюоресцентного паттерна для каждой отдельной хромосомы с 24 отдельными цветами. Эта технология позволяет определять сложные хромосомные перестройки, не видимые при использовании традиционных цитогенетических методик.

Метод FISH в пренатальной диагностике. Для женщин старшего репродуктивного возраста беременность может оказаться поводом не столько для радости, сколько для беспокойства. С возрастом женщины связан риск развития хромосомных аномалий плода. Амниоцентез, осуществляемый на 16-й неделе беременности, с последующим анализом кариотипа занимает 10-14 дней. Использование FISH в предварительном обследовании позволяет ускорить диагностику и уменьшить время ожидания. Большинство генетиков и лабораторий придерживаются мнения, что метод FISH не следует использовать изолированно для принятия решения о дальнейшем ведении беременности. Метод FISH обязательно следует дополнять кариотипическим анализом, и его результаты как минимум должны коррелировать с патологической картиной ультразвукового исследования (УЗИ) или биохимического скрининга по крови матери.

Синдромы генных последовательностей известны также под названием синдромов микроделеции, или сегментарной анеусомии. Это делеции смежных фрагментов хромосомы, вовлекающие, как правило, многие гены. Синдромы генных последовательностей были впервые описаны в 1986 г. с использованием классических методик цитогенетики. Теперь, благодаря FISH, возможна идентификация субмикроскопических делеции на уровне ДНК, что позволило выявлять наименьший делецированный регион, связанный с развитием того или иного синдрома, получивший название критического региона. После определения критического региона для синдрома зачастую становится возможным идентифицировать специфические гены, отсутствие которых признают ассоциированным с этим синдромом. В недавно вышедшем руководстве по синдромам генных последовательностей сообщают о 18 синдромах делеции и микроделеции, ассоциированных с 14 хромосомами. Некоторые наиболее часто встречающиеся синдромы генных последовательностей и их клинические проявления приведены в табл. 5-2.

Теломеры - образования, прикрывающие с концов длинные и короткие плечи хромосом. Они состоят из повторяющихся последовательностей TTAGGG и предотвращают слияние концевых участков хромосом между собой. Теломерные зонды играют важную роль в распознавании комплексных транслокаций, которые невозможно определить традиционными цитогенетическими методами. Кроме того, одним из открытий Проекта «Геном человека» был тот факт, что регионы хромосом, прилежащие к теломерам, богаты генами. В настоящее время показано, что субмикроскопические субтеломерные делеции ответственны за возникновение многих генетически обусловленных заболеваний.

Флуоресце́нтная гибридиза́ция in situ, или метод FISH (англ. fluorescence in situ hybridization - FISH), - цитогенетический метод, который применяют для детекции и определения положения специфической последовательности ДНК на метафазных хромосомах или в интерфазных ядрах in situ. Кроме того, FISH используют для выявления специфических мРНК в образце ткани. В последнем случае метод FISH позволяет установить пространственно-временные особенности экспрессии генов в клетках и тканях.
Метод FISH используют в преимплантационной, пренатальной и постнатальной генетической диагностике, в диагностике онкологических заболеваний, в ретроспективной биологической дозиметрии.

Связанные понятия

Микроядро - в цитологии фрагмент ядра в эукариотической клетке, не содержащий полного генома, необходимого для её выживания. Является патологической структурой и может наблюдаться в клетках любых тканей. Обычно микроядра образуются в результате неправильного хода клеточного деления или фрагментации ядра в процессе апоптоза.

Гомологи́чная рекомбина́ция , или о́бщая рекомбина́ция, - тип генетической рекомбинации, во время которой происходит обмен нуклеотидными последовательностями между двумя похожими или идентичными хромосомами. Это наиболее широко используемый клетками способ устранения двух- или однонитевых повреждений ДНК. Гомологичная рекомбинация также создает разнообразие комбинаций генов во время мейоза, обеспечивающих высокий уровень наследственной изменчивости, что, в свою очередь, позволяет популяции лучше адаптироваться...

Космиды (Cosmides) - плазмиды, содержащие фрагмент ДНК фага лямбда включая cos-участок. Вместе с системами упаковки в фаговые частицы in vitro используются как векторные молекулы для клонирования генов и при построении геномных библиотек. Космиды были впервые сконструированы Коллинсом и Брюнингом в 1978 году. Их название происходит от сокращения двух терминов: cos-участок (сам термин в свою очередь происходит от англ. cohesive ends - липкие концы) и плазмида.

В связи с накоплением огромного количества информации о последовательностях генов, в настоящее время, для выявления функций генов, часто используют методы обратной генетики. Исследователи манипулируют последовательностями генов, изменяя или выключая тот или иной ген, и анализируют, к каким изменениям это приводит. Это путь обратной генетики: от гена к признаку/фенотипу. Прямая и обратная генетика – не взаимоисключающие подходы, а дополняющие друг друга в изучении функции гена.
(англ. transformation) - процесс поглощения бактериальной клеткой молекулы ДНК из внешней среды. Для того, чтобы быть способной к трансформации, клетка должна быть компетентной, то есть молекулы ДНК должны иметь возможность проникнуть в неё через клеточные покровы. Трансформация активно используется в молекулярной биологии и генетической инженерии.

Негомологи́чное соедине́ние концо́в , или негомологи́чное воссоедине́ние концо́в (англ. non-homologous end joining, NHEJ) - один из путей репарации двунитевых разрывов в ДНК. Негомологичным этот процесс называется потому, что повреждённые концы цепи соединяются лигазой напрямую, не нуждаясь в гомологичном шаблоне, в отличие от процесса гомологичной рекомбинации. Термин «негомологичное соединение концов» был предложен в 1996 году Муром и Хабером. NHEJ существенно менее точен, чем гомологичная рекомбинация...

Кулли́ны (англ. cullins) - семейство гидрофобных белков, служащих скэффолдом для убиквитинлигаз (E3). Все эукариоты, как представляется, имеют куллины. Они в сочетании с RING-белками образуют куллин-RING убиквитинлигазы (CRL), которые весьма разнообразны и играют роль во многих клеточных процессах, например, протеолизе (они разрушают около 20 % клеточных белков), эпигенетической регуляции, работе иммунитета растений, опосредованного салициловой кислотой.

Секвенирование нового поколения (англ. next generation sequencing, NGS) - техника определения нуклеотидной последовательности ДНК и РНК для получения формального описания её первичной структуры. Технология методов секвенирования нового поколения (СНП) позволяет «прочитать» единовременно сразу несколько участков генома, что является главным отличием от более ранних методов секвенирования. СНП осуществляется с помощью повторяющихся циклов удлинения цепи, индуцированного полимеразой, или многократного...